Studio dell’infiammazione intestinale

L’infiammazione intestinale, causata da fattori genetici o ambientali, è alla base di patologie come la sindrome del colon irritabile (IBD), il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, oltre a costituire un importante fattore di rischio per lo sviluppo di tumori. Lo stato infiammatorio intestinale è caratterizzato da un’incontrollata risposta immunitaria verso la normale microflora residente, portando a dolore addominale e diarrea cronica che spesso persistono per un periodo di tempo estremamente lungo. Il processo infiammatorio a livello intestinale è regolato da complesse interazioni tra sistema immunitario e altre cellule localizzate nella barriera epiteliale.

Le cellule del sistema immunitario si scambiano segnali cellulari attraverso la produzione di citochine, fattori di crescita e molecole di adesione, che facilitano e amplificano il processo. Nelle cellule epiteliali stimolate dalle tipiche citochine dell’immunità innata (TNF-α, IL-1β) coinvolte nella risposta alle infezioni batteriche, sono attivate differenti vie pro-infiammatorie, attraverso la sovra-espressione della ciclo-ossigenasi-2 (COX-2), della NO sintasi inducibile (iNOS) e della MMP-9. Diversi prodotti enzimatici pro-infiammatori (ossido nitrico, prostaglandina E2) e le citochine stesse comportano la perdita d’integrità della barriera epiteliale, che diventa in tal modo suscettibile alle infezioni da parte di diversi agenti patogeni.

Il processo infiammatorio delle IBD è caratterizzato da un’importante infiltrazione di neutrofili, linfociti e macrofagi. Questi leucociti sono attratti da chemochine prodotte nella mucosa intestinale di pazienti con IBD, tra le quali, IL-8 attrae i neutrofili, CCL2 attrae i macrofagi, CXCL10 attrae i linfociti. I macrofagi residenti sono ritenuti estremamente rilevanti nella prima comunicazione tra epitelio intestinale e linfociti, principali responsabili dell’infiammazione cronica. Gli studi recenti hanno dimostrato che la produzione di IL-12 ed IL-23 da parte dei macrofagi comporta l’attivazione dei linfociti, i quali producono elevati livelli di citochine coinvolte nei processi autoimmuni come TNF-α, IFN-γ e IL-17A. Questi mediatori, insieme a quelli sopradescritti, hanno importanti funzioni effettrici sull’epitelio intestinale: l’obiettivo principale del processo è la risoluzione dell’infezione, ma l’infiammazione incontrollata porta a dolore cronico, erosione della mucosa ed ulcere intestinali, tipiche delle IBD. L’inibizione di TNF-α e IL-23, ma non di IL-12 ed IL-17A, da parte degli anticorpi monoclonali (infliximab, ustekinumab) comporta miglioramenti clinici molto rilevanti nei pazienti.Anche a livello intestinale, come a livello gastrico, l’attivazione nelle cellule epiteliali del fattore nucleare κB (NF-κB) e la sua traslocazione dal citoplasma al nucleo rappresentano il processo primario che regola la trascrizione dei mediatori dell’infiammazione.

Inoltre, molte citochine coinvolte nei processi infiammatori cronici e autoimmuni attivano il fattore di trascrizione STAT (IL-12, IL-23, IL-6, IFN-γ): anche la sua inibizione rappresenta un target terapeutico per diversi nuovi farmaci.

Metodiche utilizzate in laboratorio

Saggi in vitro

I saggi prevedono l’utilizzo di una coltura cellulare di epitelio intestinale umano (Caco-2) sia indifferenziata che differenziata ad enterociti, la principale popolazione cellulare intestinale. Tali cellule rappresentano il principale modello in vitro descritto in letteratura per studiare l’attività anti- infiammatoria nel tratto intestinale.

  1. Misurazione della trascrizione guidata da NF-κB o AP-1 in seguito a stimolo pro-infiammatorio con TNF-α, IL-1β, IFN-γ, LPS batterico di Escherichia coli o di Salmonella typhimurium.
  2. Misurazione della traslocazione di NF-κB dal citoplasma al nucleo, evento in grado di scatenare la cascata pro-infiammatoria a livello gastrico, in seguito a stimolo pro-infiammatorio con TNF-α, IL-1β, IFN-γ e LPS batterico di Escherichia coli o di Salmonella typhimurium.
  3. Rilascio di chemochine (CCL2, IL-8, CXCL10) da parte delle cellule dell’epitelio intestinale.
  4. Secrezione, espressione genica ed attività catalitica della metalloproteasi-9 in seguito a stimoli pro- infiammatori tipici delle patologie intestinali.
  5. Misurazione della traslocazione nucleare di NRF2.
  6. Effetto sul rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS).
  7. Studio della permeabilità intestinale in cellule Caco-2 mediante utilizzo di colture di enterociti su Transwell.
  8. Valutazione dell’espressione di proteine coinvolte nelle giunzioni intercellulari (TJ) intestinali in cellule Caco-2 su Transwell.
  9. Digestione in vitro con enzimi intestinali, al fine di stabilire come l’intestino modifica i prodotti di origine vegetale.

Saggi in vivo

Il saggio prevede l’utilizzo di ratti con colite ulcerosa indotta da destrano (in collaborazione con la Prof.ssa Lidia Sautebin). In tale modello è possibile valutare anche l’effetto preventivo delle sostanze allo studio. Si procede al prelievo della mucosa intestinale sulla quale siamo in grado di valutare i seguenti parametri:

  1. Effetto su citochine pro-infiammatorie
  2. Traslocazione nucleare di NF-κB.
  3. Traslocazione nucleare di NRF2.
  4. Attività antiossidante mediante test ORAC.
  5. Attività della superossido dismutasi (SOD) e catalasi.
  6. Valutazione della perossidazione lipidica mediante misurazione di MDA.
  7. Effetto sul rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS)