Studio dell’infiammazione cutanea

Il progetto ha lo scopo di investigare l’effetto antinfiammatorio a livello cutaneo di estratti di origine vegetale e molecole pure su una linea cellulare non tumorale di cheratinociti umani. I cheratinociti sono le principali cellule dell’epidermide e hanno il compito specifico di produrre la cheratina, una proteina fibrosa in grado di proteggere l’epidermide dagli insulti esterni. Tali cellule sono coinvolte in numerose patologie della pelle a carattere infiammatorio come, ad esempio, la psoriasi e la dermatite atopica. I cheratinociti secernono inoltre, in risposta a stimoli pro-infiammatori, la metalloproteasi-9 (MMP-9), una proteasi Ca-Zn dipendente la cui principale funzione è la regolazione della matrice extracellulare. Tale enzima è infatti in grado di degradare la gelatina, il collagene di tipo IV, la fibronectina, elastina e numerosi altri substrati proteici. Come conseguenza della degradazione dei componenti della membrana basale operata dalla MMP-9, le cellule del sistema immunitario, come ad esempio macrofagi, neutrofili e linfociti T, raggiungono l’epidermide durante le patologie infiammatorie della pelle.

La MMP-9 è associata a numerosi processi infiammatori, come le malattie autoimmuni e la psoriasi, ed è oggi considerato un enzima strettamente coinvolto nelle patologie cutanee. La MMP-9 è indotta, nel cheratinocita, in risposta a stimoli pro- infiammatori, come quelli prodotti da citochine quali TNF-α, IL-1β e IL-6. Recentemente, è stato dimostrato che l’istamina, uno dei principali mediatori chimici dell’infiammazione, induce un aumento dell’espressione della MMP-9 in cheratinociti umani. Tale processo potrebbe rappresentare uno dei meccanismi attraverso cui tali cellule contribuiscono alle patologie cutanee.I cheratinociti rispondono prontamente a stimoli derivanti dall’infiammazione linfocitaria. La psoriasi si associa al morbo di Crohn con cui condivide molti aspetti infiammatori: a livello cutaneo, macrofagi e linfociti T producono elevati livelli di TNF-α, IFN-γ e IL-17A. Tali citochine inducono la produzione di fattori proliferativi (VEGF, IL-8) e chemochine da parte dei cheratinociti, i quali iperproliferano e amplificano l’infiammazione.

Nella dermatite atopica, invece, i cheratinociti partecipano all’infiammazione allergica. Accanto alle citochine tipiche delle infiammazioni autoimmuni (TNF-α, IFN-γ e IL-17A), nella dermatite atopica prevalgono elevati livelli di IL-4 prodotta dai linfociti in seguito alla sensibilizzazione cutanea. I cheratinociti rispondono alla stimolazione di IL-4 alterando il loro stato di differenziamento e la barriera cutanea, ma anche producendo mediatori pro-allergici (TSLP, IL-6, eotassine, MMPs) che attraggono i granulociti eosinofili e basofili, e attivano i mastociti alla produzione di istamina. Nella dermatite atopica i segni caratteristici sono l’edema, il prurito e la lesione cutanea. 

L’inibizione del TNF-α e di IL-17A (infliximab e secukinumab) sono opzioni terapeutiche che comportano un notevole miglioramento della psoriasi. L’inibizione di IL-4, invece, ha dato importanti risultati terapeutici nella dermatite atopica. 

Metodiche utilizzate in laboratorio

Saggi in vitro

I saggi prevedono l’utilizzo di cellule HaCaT (cheratinociti umani) trattate con diversi stimoli pro- infiammatori noti per essere coinvolti nelle patologie cutanee a carattere infiammatorio.

  1. Misurazione della trascrizione guidata da NF-κB in seguito a stimolo pro-infiammatorio con TNF-α, IL-6, istamina, LPS batterico e raggi UV.
  2. Misurazione della traslocazione di NF-κB in seguito a stimolo pro-infiammatorio con TNF-α, IL-6, istamina, LPS batterico e raggi UV.
  3. Misurazione della traslocazione di NRF2.
  4. Secrezione, espressione genica (attività sul promotore e misurazione dei livelli di mRNA) ed attività catalitica di metalloproteasi in seguito a stimoli pro-infiammatori e pro-ossidanti tipici delle patologie cutanee.
  5. Effetto sul rilascio di citochine e chemochine pro-infiammatorie (IL-6, IL-8, eotassine, molecole di adesione) e sul rilascio di VEGF.
  6. Valutazione di marcatori del differenziamento cutaneo (cheratina 1 e 10, involucrina)
  7. Misurazione, mediante real time RT-PCR, di geni tipicamente pro-infiammatori a livello cutaneo (es. iNOS, COX-2);
  8. Studi di permeabilità della cute, mediante utilizzo di celle di Franz.